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黃曲霉毒素M1（Ⅰ型）ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
【概要】
黃曲霉毒素是一類真菌（如黃曲霉和寄生曲霉）的有毒的代謝產(chǎn)物，它們具有很強(qiáng)的致癌性，主要存在于谷物、堅(jiān)果、棉籽以及一些與人類血液，動(dòng)物飼料相關(guān)的產(chǎn)品中。黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1的羥基化代謝產(chǎn)物，也是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)。牛乳及其制品是易受到黃曲霉毒素M1污染的食品之一。Aflatoxin M1的檢測(cè)方法有高效液相色譜法(HPLC)，薄層層析法(TLC)等。而使用黃曲霉毒素M1 ELISA試劑盒則能夠快速而準(zhǔn)確的分析樣品中黃曲霉毒素M1殘留。
【適用范圍】
可定性、定量檢測(cè)牛奶，奶粉等樣本中的黃曲霉毒素M1的含量。
【試驗(yàn)原理】
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA原理，在微孔板上預(yù)包被黃曲霉毒素抗原，加入樣本/黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素M1抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的黃曲霉毒素M1與預(yù)包被在微孔板上的黃曲霉毒素抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素M1抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時(shí)被除去。再加入TMB顯色液，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素M1的含量成負(fù)相關(guān)。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉毒素M1的含量。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏度：0.1ppb
【交叉反應(yīng)率】
結(jié)構(gòu)類似物 交叉反應(yīng)率
黃曲霉毒素B1 …………………………………………………………… 30%
黃曲霉毒素B2 …………………………………………………………… 5%
黃曲霉毒素G1 …………………………………………………………… 15%
黃曲霉毒素G2 …………………………………………………………… 7%
黃曲霉毒素M1 …………………………………………………………… 100%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb
3. 濃縮酶標(biāo)記物 1瓶 ………………………………… 1ml
4. 酶標(biāo)稀釋液1瓶 …………………………………… 7ml
5. 顯色液1瓶 ………………………………………… 12ml
6. 終止液1瓶 ………………………………………… 10ml
7. 濃縮洗滌液 （10×）1瓶 ……………………… 50ml
【需要而未提供的設(shè)備及試劑】
設(shè)備：
┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm
┅┅振蕩器
┅┅離心機(jī)
┅┅天平：感量0.01g
┅┅微量移液器：?jiǎn)蔚?20μl～200μl、200μl～1000μl，八道 300μl
試劑：
┅┅去離子水
【試劑配制】
1. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水）。
2. 酶標(biāo)物的配制(現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存)：將濃縮酶標(biāo)記物與酶標(biāo)稀釋液按1：19體積比進(jìn)行稀釋（1份酶濃縮液+19份酶標(biāo)稀釋液。
【樣本前處理步驟】
一、 牛奶（稀釋倍數(shù)：1）
1. 取待測(cè)樣品，7000rpm室溫下離心，5min；
2. 取下層100μl待測(cè)。
二、 奶粉（稀釋倍數(shù)：5）
1. 取1.0g奶粉，加入5ml去離子水，混勻；
2. 7000rpm室溫下離心，5min；
3. 取下層100μl待測(cè)。
【檢測(cè)步驟】
一、測(cè)定前須知：
1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。
2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2～8℃。
3. ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點(diǎn)。
4. 在所有恒溫孵育過(guò)程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。
二、操作步驟：
1. 將所需試劑及微孔板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出所需數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷凍。
3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。
4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對(duì)應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)30min。
6. 小心揭開(kāi)蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。
7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)30min。
8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。
【結(jié)果判定】
1. 百分吸光率的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素M1實(shí)際含量。
【注意事項(xiàng)】
1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有恢復(fù)到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2. 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3. 每種試劑使用前均需搖勻。
4. 反應(yīng)終止液為0.5M硫酸，避免接觸皮膚。
5. 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒；也不要摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
6. 儲(chǔ)存條件：
試劑盒保存于2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新真空密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的顯色劑對(duì)光敏感，因此要避光保存。
7. 試劑變質(zhì)的跡象：
顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8. 加入顯色液后，一般顯色時(shí)間為15～30min。若顏色較淺，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到35min（或更長(zhǎng)），但不得超過(guò)40min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。
9. 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【樣品最低檢測(cè)限】
牛奶………………………………………………0.1ppb
奶粉………………………………………………0.5ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：保存試劑盒于2～8℃。
保存期：該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。
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