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黃曲霉毒素B1（Ⅲ型）ELISA檢測試劑盒說明書
【概要】
黃曲霉毒素是曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉的二次代謝產(chǎn)物，是自然界最危險的致癌物質(zhì)之一，廣泛存在于谷物、堅果、棉籽以及以此為原料生產(chǎn)的各種食品、油料、酒類、飼料中，并能通過動物體產(chǎn)生同樣有害的代謝產(chǎn)物，存在于牛奶及奶制品，肉類甚至人體血液，組織中。
黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的是黃曲霉毒素B1，是世界衛(wèi)生組織規(guī)定的I類致癌物質(zhì)，毒性是砒霜的68倍，其幾乎一直和黃曲霉毒素B2、G1 和 G2共存，是肝癌的三大致病因素之首。世界大部分國家和地區(qū)都已對食品和飼料中的黃曲霉毒素最高允許水平作了規(guī)定，因此，準(zhǔn)確測定食品及飼料中的黃曲霉毒素含量對于食品安全監(jiān)控具有重要意義。
【適用范圍】
可定性、定量檢測嬰兒配方食品，嬰兒輔助食品等樣本中的黃曲霉毒素B1。
【試驗原理】
本試劑盒采用競爭ELISA原理，在微孔板上預(yù)包被黃曲霉毒素B1抗體，加入樣本/黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素B1抗原。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的黃曲霉毒素B1與辣根過氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素B1抗原競爭結(jié)合預(yù)包被在微孔板上的黃曲霉毒素B1抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗原在洗滌時被除去。再加入TMB顯色液，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素B1的含量成負(fù)相關(guān)。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉毒素B1的含量。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏度：10ppt（0.01ppb）
【交叉反應(yīng)率】
結(jié)構(gòu)類似物 交叉反應(yīng)率
黃曲霉毒素B1 …………………………………………………………… 100%
黃曲霉毒素B2 …………………………………………………………… 15%
黃曲霉毒素G1 …………………………………………………………… 11%
黃曲霉毒素G2 …………………………………………………………… 4%
黃曲霉毒素M1 …………………………………………………………… 0.5%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppt,10ppt,20ppt, 40ppt, 80ppt,160ppt
3. 酶標(biāo)物1瓶 ……………………………………………6ml
4. 顯色液1瓶 …………………………………………12ml
5. 終止液1瓶 …………………………………………10ml
6. 濃縮洗滌液 （10×）1瓶………………………… 50ml
7. 濃縮樣品稀釋液（10×）1瓶 ……………………50ml
【需要而未提供的設(shè)備及試劑】
設(shè)備：
┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm
┅┅振蕩器
┅┅粉碎機(jī)
┅┅離心機(jī)
┅┅天平：感量0.01g
┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl、八道300μl
試劑：
┅┅甲醇（分析純）
┅┅去離子水（或蒸餾水）
【試劑配制】
1. 樣品稀釋液：將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水）。
2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水）。
3. 80%甲醇水：將甲醇用去離子水按80:20體積比進(jìn)行稀釋（8份無水甲醇+2份去離子水）。
【樣本前處理步驟】
嬰幼兒配方食品，輔助食品等（稀釋倍數(shù)：24）
1. 取3.0g粉碎的樣品與9.0ml 80%甲醇混合均勻；
2. 強(qiáng)力振蕩3min；
3. 2000g離心10min；
4. 取上層清液100μl，加入700μl樣品稀釋液，混合均勻；
5. 取100μl稀釋后液體待測。
【檢測步驟】
一、 測定前須知：
1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。
2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2～8℃。
3. ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點。
4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。
二、操作步驟：
1. 將所需試劑及微孔板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出所需數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷凍。
3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。
4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本100μl到對應(yīng)的微孔中，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
6. 再加入酶標(biāo)物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)5min。
7. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。
8. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
9. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。
【結(jié)果判定】
1. 百分吸光率的計算
標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素B1實際含量。
【注意事項】
1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有恢復(fù)到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3. 每種試劑使用前均需搖勻。
4. 反應(yīng)終止液為0.5M硫酸，避免接觸皮膚。
5. 不要使用過了有效期的試劑盒；也不要摻雜使用過了有效期的試劑盒；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6. 儲存條件：
試劑盒保存于2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新真空密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的顯色劑對光敏感，因此要避光保存。
7. 試劑變質(zhì)的跡象：
顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8. 加入顯色液后，一般顯色時間為15～30min。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到35min（或更長），但不得超過40min。反之，則減短反應(yīng)時間。
9. 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【樣品檢測范圍】
嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品………………………………………0.24ppb — 3.84ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：保存試劑盒于2～8℃。
保存期：該產(chǎn)品有效期為12個月。
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